放射線滅菌工程管理用バイオロジカルインジケータ

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作成： 1996/09/05 関口　正之データ番号　　　：040035 放射線滅菌工程管理用バイオロジカルインジケータ目的　　　　　　：バイオロジカルインジケータの特性評価と安定性放射線の種別　　：ガンマ線放射線源　　　　：ガンマ線照射装置線量（率）　　　：1.8-16kGy(1.5kGy/h -20kGy/h) 利用施設名　　　：日本アイソトープ協会甲賀研究所,東京都立アイソトープ総合研究所第1照射室照射条件　　　　：空気中、温度(5-25℃、室温) 応用分野　　　　：食品照射、包装材料、動物飼料、医薬原料概要　　　　　　：バイオロジカルインジケータ(BI)は、滅菌法に対して高い抵抗性を持つ指標菌の一定量を紙等の担体に付加したもので、滅菌処理後の死滅の有無から滅菌の可否を判定する生物学的手段である。特に滅菌工程管理のパラメータの多い他の滅菌法では不可欠な手段となっている。本抄録では、放射線滅菌の指標菌バチルスプミルスの性質及びこの菌で作成したBIの保存安定性、滅菌判定等に与える線量と培養条件に関する研究を概説した。詳細説明　　　　： 1.コロニー形態とバチルス・プミルスE601(ATCC27142)の放射線抵抗性放射線滅菌のバイオロジカルインジケータ(BI)に用いられるバチルス・プミルスE601を継代培養するとコロニー形態の異なるラフ型とスムーズ型菌が現れる。そのためこの菌を指標微生物とする場合、放射線抵抗性に違いのないことを確認する必要がある。ラフ型(BPー3)菌を培養し生じた2種類のコロニーを純粋分離し、スムーズ型(BPー1)及びラフ型(BPー2)菌株を得た。これらの菌株を2つの胞子形成培地で培養し、作成したBIの放射線抵抗性を比べた結果を表1に示す。表1　Spore crop yield and D_M_r_a_d-values for strains of Bacillus pumilus E601(ATCC #27142).（原論文1より引用） -------------------------------------------------------------------------- Culture* Media Combination A** B*** --------------------------- ------------------------------ Final Final titer D-value Final Final titer D-value volume (spores/ml) (Mrad) volume (spores/ml) (Mrad) (ml) (x 10¹⁰/ml) **** (ml) (x 10¹⁰/ml) **** -------------------------------------------------------------------------- BP-1(rough) 20 6.7 0.25 50 14.0 0.25 BP-2(smooth) <1.0 - - 45 10.0 0.26 BP-3(rough) <1.0 - - 20 1.7 0.28 -------------------------------------------------------------------------- *BP-1(rough)and BP-2(smooth)are isolates of B.pumilus E601(ATCC #27142). BP-3(rough)is B.pumilus E601 (ATCC #27142),a culture that was in the stock culture collection. **Medium A combination: starter culture medium contained (g/l): Trypticase soy broth (BBL), 35 g; soluble starch (Difco), 1 g; yeast extract (BBL),2 g; and distilled water, 1 l.Sporulation medium contained (g/l): Typticase soy broth (BBL), 35 g; agar (BBL), 18 g; soluble starch (Difco), 1 g; yeast extract (BBl), 2 g; and distilled water, 1 l. ***Medium B combination: starter culture medium contained (g/l): tryptone (Difco), 10 g; yeast extract (BBL), 5 g; K₂HPO₄, 2 g;and distilled water, 1 l. Sporulation medium contained (g/l): Trypticase (BBL), 5 g; phytone (BBL), 3 g; beef extract (BBL), 5 g; MnSO₄・2H₂O, 0.15 g; CaCl₂, 0.01 g; agar (BBL), 20 g; and distilled water, 1 l. ****Dose rate: 0.15 Mrad/hr, ⁶⁰Co. この表から、コロニー形態の異なる菌株の放射線抵抗性に差はほとんどなく、胞子形成培地の影響もないので、コロニー変異は抵抗性と無関係であることが明らかとなった。 2.BIの保存安定性 BIは滅菌工程を監視する手段として用いられるので、放射線に対して一定の抵抗性を長期間安定して保持していなければならない。BIの抵抗性は、指標微生物の塗布菌数と放射線抵抗性によって決まるので、両者がいかに安定であるかを検証する必要がある。 BPー1,BPー2,BPー3から作成したBI(担体：紙)の菌数は36週間以上安定であり,培養歴の異なる菌株の3ヶ月間保存時のD値(90%殺菌線量)は多少のばらつきが認められたが類似していた。保存安定性は、担体(セルローズファイバーろ紙、ガラスファイバーろ紙)及び保存温度(室温、25℃、5℃)に影響を受け、5℃保存が最もよく、セルローズファイバーろ紙では1年後、ガラスファイバーろ紙では6ヶ月程度まで菌数の減少がほとんどなかった。また、同一試料でD値の変化を調べた結果を表2に示す。表2　水懸濁液を塗布したセルローズ・ファイバー濾紙上胞子のD値の経時変化(単位：MR) (D値は線量範囲0～3Dにおける平均値3D／3として求めた)（原論文2より引用） ---------------------------------------------------------------- 保存温度　１日保存　７日保存　１０４日保存　６カ月保存　１年保存 ---------------------------------------------------------------- 室　温　 0.17₄ 0.17₃ 0.17₁ 0.17₄ 0.17₃ ---------------------------------------------------------------- 25 ℃ 0.17₈ 0.17₄ 0.17₀ 0.17₃ 0.17₆ ---------------------------------------------------------------- 5 ℃ 0.17₆ 0.17₀ 0.17₈ 0.18₁ 0.17₈ ---------------------------------------------------------------- 表より、セルローズファイバーろ紙のBIでは、保存期間が1年まで0.17-0.18MRのD値を示し、菌数減少は起こっても放射線抵抗性は変化しない。栄養細胞型細菌のマイクロコカッス・ラジオデュランスのBIは、菌数は9ヶ月安定のものもあったが、保存によるD値のばらつきと低下が大きく、ルーチンコンロトールには適さない。 3.指標菌の抵抗性に影響を与える因子照射前の調湿(25%、50%、75%)及び塗布濃度(1x10⁵、1x10⁶、1x10⁷胞子／担体)は,バチルス・プミルスのBI(担体：紙)の放射線抵抗性にほどんど差を与えなかった.1.5kGy及び2kGy,8kGy／時間の線量率で放射線抵抗性を比較した場合,低線量率ほどD値が大きくなった.しかし、1桁に満たない線量率の違いが放射線抵抗性に大きな影響を与える事例は他にはなく、この点は再検討されるべき内容である。また、実施設での照射を考慮して連続及び分割照射のD値へ与える影響や製品付着菌のバイオフィルムによる防護を想定し、共存物を含む胞子懸濁液から作成したBIでの放射線抵抗性の評価なども滅菌保証を高めるため行われている。 4.BIの判定条件 BIは、指標菌の増殖の有無により判定するが、照射BIは生存菌数が少なく、ダメージも受けているので、培養条件(培地、温度、期間)の設定は重要である。トリプチケースソイブロス(TSB)、コロンビアブロス(CB)、チオグリコール酸培地Ⅰ(TGC)の各培地について、指標菌の陽性発現の経時変化を調べた。TSBでの結果を図1に示す。図1　γ線照射BI(トリプチケースソイブロス：32℃培養)（原論文3より引用）照射BIの陽性率が一定となる最小培養期間はTSBの場合、培養2日目であり、CBは4日目、TGCは8日目となった。TSBは、他に比べBIの判定に最適な培地と言える。また、BIは製品無菌試験より滅菌工程の検証を短期間で可能にしうる手段でもある。コメント　　　　：バイオロジカルインジケータ(BI)は、工程管理のパラメータの多い酸化エチレンガスや高圧蒸気滅菌法などでは滅菌工程管理に不可欠な手段であり、国際規格(ISO)も作成されている。放射線滅菌でも、BIの他に照射施設の開設及び改修時または施設間の性能評価を、指標菌の不活性化係数から求める微生物標準品の使用が推奨され、仕様や安定性についての研究が行われてきた。しかし、いずれも用いられる指標菌の種類、作成方法(培養条件、担体や包装の種類、塗布濃度、共存物質)、抵抗性評価方法についての規定は滅菌線量についての考え方の違いを反映して国により対応は異なっている。近年、環境や製品中には指標菌より高い抵抗性を持つ微生物の存在が明らかになるにつれ、製品に自然な状態で存在する汚染微生物の放射線抵抗性分布に基づいて滅菌線量を決めようという考え方が広まってきた。このことは、人為的に作られたBIの使用から高い精度と信頼性を持つ線量計及び計測制御装置による滅菌工程管理への移行を加速させたと言いうる。日本では、まだBIの使用を必要としているが、ISO規格では、放射線滅菌に関するBIの使用についての記述はなく、滅菌工程管理における必要性は低下しつつある。原論文１ Data source 1： Resistance Levels for Biological Indicators for Use in Sterilization by Ionizing Radiation, R. Berube, Corporate Quality Assurance, Becton, Dickinson & Company, Research Triangle Park, North Carolina, Sterilization of Medical Products, Ed. by E. R. L. Gaughran and K. Kereluk, Johnson & Johnson, p169 (1977) 原論文２ Data source 2：放射線滅菌工程管理用　Biological indicatorの安定性に関する検討立石　恒夫、木川　秋子、木村　俊夫、真室　哲雄日本アイソトープ協会甲賀研究所,〒520-34　滋賀県甲賀郡甲賀町鳥居野中山谷121-19 医器学,Vol.55, No.6, p293(1985) 原論文３ Data source 3：バイオロジカルインジケータの培養について田部井　雅枝、関口　正之東京都立アイソトープ総合研究所,〒158　東京都世田谷区深沢2-11-1 東京都立アイソトープ総合研究所研究報告, No.9, p.21 (1992) 参考資料１ Reference 1： Stability of Bacillus pumilus Spore Strips Used for Monitoring Radiation Sterilization H. N. Prince Research Department, Gibraltar Biological Laboratories, Inc. Appl. Environ. Microbiol. , Vol.31, No.6, p999 (1976) 参考資料２ Reference 2： Studies on the dose requirement for the radiation sterilization of medical equipment. Ⅰ. Influence of Suspending Media M. M. Burt and F.J. Ley J. Appl. Bacteriol., 26, p484(1963) 参考資料３ Reference 3： Sterilization of Bacillus Spores by Converted X Rays H.. Ito, Y. Ohki, Y. Watanabe, H. Sunaga and I. Ishigaki Takasaki Radiation Chemistry Research Establishment, Japan Atomic Energy Research Institute, Watanuki-machi 1233, Takasaki, Gunma 370-12, Japan Radiat. Phys. Chem., Vol.42, Nos.4-6, p597 (1993) 参考資料４ Reference 4： Studies on the Dose Requirement for the Radiation Sterilization of Medical Equipment. Ⅱ. A Comparison between Continuous and Fractionated Doses M. M. Burt and F.J. Ley J. Appl. Bacteriol., 26, p490(1963) 参考資料５ Reference 5： Validation/Certificaton of an Irradiation Facility P. M. Borick Radiat. Phys. Chem., Vol.15,No.6, p115 (1980) 参考資料６ Reference 6：講座/滅菌操作と効果確認　4.生物学的インジケータ佐藤　健二東京都立アイソトープ総合研究所防菌防黴,Vol.7, No.2, pp35-41(1979) 参考資料７ Reference 7：ディスポーザブル医療用具の放射線滅菌工程に関する指針及び解説日本医療器材協会日本医療器材協会、〒104　東京都中央区銀座1-4-6 平成2年10月キーワード：バイオロジカルインジケータ,放射線滅菌,滅菌保証,指標菌,放射線抵抗性,無菌試験,工程管理 biological indicator, radiation sterilization, sterility assurance, standard microorganisms, radiation resistance, sterility test, process control 分類コード：040302
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