作成： 1998/10/25 等々力 節子
データ番号 ：020101
DNA損傷を指標とした照射食品の検知
目的 ：照射食品の検知法の開発
放射線の種別 ：ガンマ線,電子
放射線源 ：電子加速器(10MeV)、Co-60線源
線量（率） ：ガンマ線：0.13Gy/s, 0.16Gy/s 0.26Gy/s 電子線 108 Gy/s
利用施設名 ：Gammacell 220 , Circe III Linear Accelerator (Karlsruhe)
照射条件 ：常温、空気中
応用分野 ：食品照射、殺菌、殺虫、
概要 ：
DNAコメットアッセイは、多種類の食品に対して照射の有無を迅速に判別できる方法として非常に有望である。動物性食品(肉類)及び植物性食品(種子、乾燥果物、スパイス類)に適合したプロトコールを完成させ、これに基いて複数の研究室間でブラインドテストを行った結果、非常に高い確率で(正答率； 93〜94%(肉類)、95%(種子類))照射の有無の判別が可能であることが示された。
詳細説明 ：
DNAは細胞内における放射線の標的であり、どのような生物にも普遍的に分布することから、その損傷を指標に照射の有無を判別する技術を開発することは、動物性および植物性の生鮮食品に広く応用できる検知技術を提供できるものと期待が持たれてきた。これを受けて,従来から放射線生物学の中で研究されてきたDNAの損傷；塩基の損傷、DNAの変性、DNA鎖の切断などを、GC-MS、蛍光法、密度勾配遠心法、フィルター溶出法、パルスフィールド電気泳動などによって検出することで検知を行う試みがなされた。これらの結果は、EU内の標準分析法を検討する委員会(Community Bureau of Reference;BCR)の中でも検討が加えられ、その結論が1994年までに報告されている(参考資料1)。その結果、いくつかの方法については、食品中DNAの損傷を検出することが可能である事が示されたが、実際に検知法として応用するためには、操作が煩雑でないこと、ほかの処理(加熱や冷凍など)の影響を排除できることなどの要件を満たす必要があり、これにかなうものとして、コメットアッセイ(single cell micro gel electrophoresis)及び、肉類のミトコンドリアDNAの損傷を検出する電気泳動法(参考資料2)が有望と報告された。
コメットアッセイ(single cell micro gel electrophoresis)は、細胞懸濁液(または、核の懸濁液)にアガロースを加えてスライドグラス中でゲルを形成させ、これをSDS、サルコシル硫酸などの界面活性剤で処理することにより,細胞のLysis、核蛋白質の溶解を行ったのちに電気泳動にかけ、DNA部分を染色して顕微鏡下で観察するものである。豚肉についてこの方法を適用した例を示す（図１）。
図1 Typical DNA comets from frozen pork. Silver staining. Microscope objective X20.
A：Unirradiated. B：Irradiated with 3kGy. C：Irradiated with 5kGy. （原論文1より引用。 Reproduced from Mutation Research 375(1997) pp 167-181, Fig.2(p.172), Cerda H., Delincee H., Haine H. and Rupp H., The DNA "quotcomet assay" as a rapid screening technique to control irradiated food; Copyright(1997), with permission from Elsevier Science.）
放射線照射によって切断されたDNAはより大きな移動度を持つため、核全体のDNAの染色像は、彗星(コメット)のような形を呈する。それに対し、コントロールの細胞では、長いテールは、見られずに電気泳動像は円に近い形となる。この方法では、きわめて高い感度で個々の細胞についてのDNA損傷(DNA鎖切断)を検出することが可能であるが、食品照射で使われるDoseの範囲にあわせた電気泳動の条件と、迅速なゲルの作成方法を加味したプロトコールが作成された。
この方法を用いて、肉類について数キログレイオーダーの照射の有無が迅速に判断できることが複数の研究者から報告されている。また、0から5kGyまでの照射をおこなった鶏肉および豚肉について、9つの研究室が参加して行われたブラインドテストの結果では、93%の精度で照射の有無の判別が可能であった。ただしこの方法は、あくまでも一次スクリーニングに用いるべきで、照射の疑いが持たれたサンプルの確定には、ESRなどの方法をを導入して判断することが望ましい。
植物を対象としたコメットアッセイは、馬鈴薯やタマネギに応用した場合必ずしもよい再現性がえられていない。しかし、種子などを対象とした場合には、照射の有無によって明確なコメット像が観察されている。
また、表1に挙げたような種子、香辛料類を対象に0から5kGyの範囲で照射した未知サンプルを作成し、それぞれについて標準サンプル(線量既知のサンプル)を観察した上でブラインドテストを行った結果、照射後10ヶ月保存した場合でも、極めて高い正解率(95%)で照射の有無の判定が可能であった。
表1 DNA comet assay of plant foods for detection of irradiation treatment.（原論文1より引用。 Reproduced from Mutation Research 375(1997) pp 167-181, Tab.3(p.173), with permission from Elsevier Science.）
DNA comet assay of plant foods for detection of irradiation treatment
--------------------------------------------------------------------------------------
Sample type Actual radiation Estimation from analysis Accuracy of estimates
dose ------------------------ ----------------------
(kGy) Has it been irradiated? Correct identification
------------------------ ----------------------
Laboratory Laboratory
------------------------ ----------------------
A B C D A B C D
-----------------------------------------------------------------------------------------
Almond 0 No No No No Yes Yes Yes Yes
1 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
Fig 0 No No No No Yes Yes Yes Yes
5 No Yes Yes Yes No Yes Yes Yes
Lentil 0 No No No No Yes Yes Yes Yes
0.2 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
1 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
Linseed 0 No No No No Yes Yes Yes Yes
1 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
5 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
Rose pepper 0 No No Yes No Yes Yes No Yes
5 No Yes Yes Yes No Yes Yes Yes
Sesame seeds 0 Yes No No No No Yes Yes Yes
1 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
5 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
Soya beans 0 No − No No Yes − Yes Yes
1 Yes − Yes Yes Yes − Yes Yes
Sunflower seeds 0 No No No No Yes Yes Yes Yes
1 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
5 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
-----------------------------------------------------------------------------------------
表１に挙げた他、イチゴ、carioca、macacar beansなどについても1kGyの照射が容易に判別できることが示されている。また、最近では、Lentil,ヒマワリについては25Gy以上（図２）、ダイズ、ゴマ、Linseedについては100Gy以上の低線量でも判別が可能であることが報告された。
図2 Cometsfrom single cells of sunflower seeds, unirradiated (above) or irradiated with 200 Gy (below). The comets were visualised by staining with propidium iodide and photographed with an ISO 400 black and white film.（原論文2より引用。 Reproduced from Lebensm.-Wiss. u-Technol.,30(1997), 452-457, Figs.1&3(p.454&456), Koppen, G. Cerda H., Identification of Low dose Irradiated seeds using the Neutral Comet assay; Copyright(1997), with permission from Elsevier Science. (注：コメットの尾の長さに相当する解析パラメータ)のプロット。データは、50個の核を観察した結果。 (●)平均値；(bar)標準偏差；(box)標準誤差。）
原論文１ Data source 1：
The DNA "quotcomet assay" as a rapid screening technique to control irradiated food.
Cerda H.1), Delincee H.2), Haine H.3) and Rupp H.4)
1)Department of Radioecology, The swedish University of Agricultural Science, P.O.box 7031,S-75007 Uppsala,Sweeden, 2) Institute of Nutritional Physiology, Federal Research Centre for Nutritrion(BEF), Engesserstr.20,D-7500 Karlsruhe,Germany, 3)Campden & Chorleywood Food Research Association, Chipping Campden, Gloucestershire, ESEAR GL55 6LD, UK, 4)Swiss Federal Office of Public Health, Section of Food Chemistry, P.O. Box,CH-3000 Berne 14, Switzerland.
Mutation Research 375(1997) pp 167-181.
原論文２ Data source 2：
Identification of Low dose Irradiated seeds using the Neutral Comet assay
Koppen, G. Cerda H.*
Flemisch Institute of Thechnological Research (VITO) Environmental Department, Boeretang 200, 2400 Mol, Belgium *Department of Radioecology, The swedish University of Agricultural Science, P.O.box 7031,S-75007 Uppsala, Sweeden
Lebensm.-Wiss. u-Technol.,30(1997), 452-457.
参考資料１ Reference 1：
Report of DNA group
Delincee, H.,Marchioni,E*. and Hasselmann, C*.
Institute of Nutritional Physiology, Federal Research Centre for Nutritrion(BEF), Engesserstr.20,D-7500 Karlsruhe 1,Germany, *Faculty of Pharmacy, Department of Food Science, F-67400 Irkirch, France
Europian Comition Community bureau of Reffernce(1994),BCR Information "Concernned Action of Community Bereau of Refference on Method of Identification of Irradiated Foods" pp3-9.
参考資料２ Reference 2：
Alteration of mitochondorial DNA: A method for the detection of irrdiated beef liver.
Marchioni, E.,Touch,M.,Zumsteeg,V.,Kunz F., and Hasselmann C.
Faculty of Pharmacy, Department of Food Science F-67400 Irkirch, France
Radiat. Phys. Chem.,40,(1992)485-488
キーワード：食品照射, DNA, DNA 切断,コメットアッセイ, ミクロゲル電気泳動,照射食品の検知, 種子、肉類、家禽肉、
food irradiation, DNA, DNA breakage, Comet assay, micro-gel electrophoresis, irradiated food detection, seed, meat, poultry meat
分類コード：020404