作成： 1997/12/08 長谷川 博
データ番号 ：020075
高等植物におけるリジン+スレオニン抵抗性を指標とした高スレオニン含有突然変異体の選抜
目的 ：アミノ酸代謝に関わる突然変異体を用いた高アミノ酸含有植物の育成と植物生化学研究
放射線の種別 ：ガンマ線,中性子
放射線源 ：紫外線(15W Sylvania Lamp)(原論文1)
速中性子、ガンマ線(参考資料1)
フルエンス（率）：700erg/mm2 (原論文1)
利用施設名 ：Bhabha Atomic Reserch Centre, India (参考資料1)
照射条件 ：空気中
応用分野 ：作物育種、アミノ酸代謝研究
概要 ：
穀物のタンパク質に不足しているリジン、スレオニン等のアスパラギン酸由来のアミノ酸の含量を高めるための基礎研究として、タバコ野生種のプロトプラストに紫外線を照射し、リジン+スレオニン(LT)抵抗性を指標として高スレオニン含有突然変異体の育成が可能なことを示した。さらに、LT抵抗性突然変異は放射線でも誘発可能なこと、突然変異体の茎葉だけでなく種子中のスレオニン含有率も増加することが明らかになった。
詳細説明 ：
植物のアミノ酸合成には負のフィードバック制御が機能しており、過剰に生産されたアミノ酸は生合成過程の酵素作用を阻害する。この制御機構に不感応性を示す突然変異があり、その特徴は対象となるアミノ酸を遊離のかたちで植物体内に貯えることである。リジンとスレオニンは穀物中のタンパク質に少なく、これらアミノ酸含量を強化した作物の育成が重要視されている。リジンとスレオニンの混合溶液(LT)は植物の生育を阻害するが、これは同アミノ酸合成経路にある aspartate kinase あるいは dihydrodipicolinate synthase が阻害されるためである。LT抵抗性の突然変異体ではこれらの酵素作用にフィードバック阻害が生じないことが期待されることから、同抵抗性を指標としたリジンやスレオニンの含有率の高い作物を育種することが試みられている。
原論文の実験ではタバコ野生種の1種 Nicotiana sylvestris のプロトプラスト(3.8x107)に紫外線を照射した。照射後プロトプラストをLT(0.75mM;L+0.25mM;T)を含む培地で培養し、得られたLT抵抗性コロニーより再分化植物を獲得している。コロニーから得られたカルス(2mM;L+1.5mM;T)および再分化個体と翌代の種子(3mM;L+2mM;T)でLT抵抗性を確認したものを、LT抵抗性系統として認めている。
その結果、12のLT抵抗性系統が選抜され、そのなかの1系統RLT70について遺伝・生化学特性が調べられた。RLT70の葉の遊離スレオニン含量は原系統の47倍と著しい増加がみられ、総タンパク質当たりでもスレオニン含量は13倍に増加した。RLT70では遊離のリジン、メチオニン、イソロイシンなども増加しており、LT抵抗性を指標とした高アミノ酸含有作物育成の可能性が示された(表1)。
表1 Total (free+protein-bound) amino acid analysis of wild-type and RLT70 leaves: absolute values (in nmoles g-1 fresh weight) and percentages. （原論文1より引用。 Reproduced from Theoretical and Applied Genetics 82: 273-282 (1991), Tab.2(p.276), V.Frankard, M.Ghislain, I.Negrutiu and M.Jacobs, High threonine producer mutant of Nicotiana sylvestris (Spegg. and Comes); Copyright(1991), with permission from Springer-Verlag and authors.）
-------------------------------------------------------------
Amino acid Wild type RLT 70 Wild type RLT 70
(nmoles g-1 fresh weight) (% of total)
-------------------------------------------------------------
Aspartate 18,006 29,345 10.3 7.3
Threonine 9,134 118,960 5.2 29.6
Serine 9,697 15,962 5.5 4.0
Glutamate 18,009 28,796 10.3 7.2
Proline 9,505 14,355 5.4 3.6
Glycine 17,163 28,024 9.8 7.0
Alanine 18,028 27,646 10.3 6.9
Cysteine 150 510 0.1 0.1
Valine 12,929 20,068 7.4 5.0
Methionine 1,892 4,536 1.1 1.1
Isoleucine 9,430 17,139 5.4 4.3
Leucine 15,580 24,234 8.9 6.0
Tyrosine 4,216 7,790 2.4 1.9
Phenylalanine 7,918 12,600 4.5 3.1
Histidine 3,114 7,856 1.8 2.0
Lysine 13,323 29,556 7.6 7.4
Arginine 6,998 14,722 4.0 3.7
Total 175,092 402,099
-------------------------------------------------------------
RLT70のLT抵抗性は単一の劣性核遺伝子に支配されており、抵抗性遺伝子がヘテロの個体におけるLTの同酵素に対する阻害効果はホモ個体と野生型の中間であった(表2)。
表2 Inhibition of aspartate kinase in wild type and RLT70 mutant in percentage of total enzymatic activity, in the presence of lysine and/or threonine at a final concentration of 10mM.（原論文1より引用。 Reproduced from Theoretical and Applied Genetics 82: 273-282 (1991), Tab.4(p.278), with permission from Springer-Verlag and authors.）
------------------------------------------------------
+Lysine +Threonine +Lysine
+Threonine
------------------------------------------------------
Wild type 70-80 20-30 90-100
RLT 70
Heterozygote 30-40 20-30 50-60
Homozygote 0-10 20-30 20-30
------------------------------------------------------
また、リジン、あるいはLTによる aspartate kinase の阻害効果はRLT70において低いことが認められた。
参考資料1の文献はLTが暗黒下で育成された植物を光条件に戻したときに黄化葉の緑色化を阻害すること、緑色化を指標としてLT抵抗性個体の選抜が可能なことを報告している。この方法により、速中性子あるいはガンマ線照射により誘発された種々の形態変異を示すヒヨコマメの突然変異系統73のなかから、LT抵抗性を示す2系統が獲得されている。参考資料1はLT抵抗性突然変異体を選抜するための効率的な方法を示すとともに、同突然変異体がガンマ線照射により誘発できることを示すものである。
参考文献2の文献ではオオムギにおいてアジ化ナトリウム処理後代のM2種子からLT抵抗性突然変異体として選抜された個体から、種子中の遊離スレオニン含量が原品種の10倍高い系統が得られたことが示されている。スレオニン含量を増加させるのはaspartate kinaseに関与する2種類の遺伝子でることも明らかにされている。これらの結果は高アミノ酸含有突然変異が個体レベルでも選抜可能なこと、穀粒中のアミノ酸含有率の改善にも有用なことを示すとともに、植物におけるアミノ酸合成の遺伝子支配に重要な知見をもたらしている。
コメント ：
LT抵抗性は細胞から個体レベルまでの高スレオニン含有突然変異体の選抜に有効である。リジンとスレオニンの混合溶液は多くの場合両者の等モル溶液が用いられる(参考文献2)。LT抵抗性を指標とした場合ではリジン含量が著しく高い植物を得ることが困難とされているが、これはLT抵抗性植物の多くが aspartate kinase の作用だけを阻害するためと考えられている。
このようにアミノ酸代謝のフィードバック阻害効果に不感応性を示す突然変異体を利用した方法は他のアミノ酸含量を高めることにも有効とされるが、食味の低下と収量性の低下を伴うことが知られており実用化はされていない。しかしながら、これら突然変異体は植物のアミノ酸代謝の生化学、分子生物学研究面には大きな寄与をしている。
原論文１ Data source 1：
High threonine producer mutant of Nicotiana sylvestris (Spegg. and Comes)
V.Frankard, M.Ghislain, I.Negrutiu and M.Jacobs
Laboratorium van Plantengenetica, Instituut voor Moleculaire Biologie, Belgium
Theoretical and Applied Genetics 82: 273-282 (1991)
参考資料１ Reference 1：
A simple procedure for rapid preliminary screening for lysine plus threonine resistance in green gram (VIGNA RADIATA)
J.K.Sainis and S.R.RAO
Biology and Agricuclture division, Bjabha Atomic Research Centre, India
Plant Science Letters 25: 91-98 (1982)
参考資料２ Reference 2：
Two genes for threonine accumulation in barley seeds.
Simon W.J.Bright, Joseph S.H.Kueh, Julian Franklin, Sven Erik Rognes* and Benjamin J. Miflin
Biochemistry Department, Rothamsted Experimental Station, U.K., * Botanical Institute, University of Oslo, Norway
Nature 299: 278-279 (1982)
キーワード：アミノ酸生合成、スレオニン、リジン+スレオニン抵抗性、突然変異、Nicotiana sylvestris、紫外線照射、プロトプラスト
Amino acid biosynthesis, Threonine, Lysine+threonine resistance, Mutation,
Nicotiana sylvestris, UV irradiation, Protoplast
分類コード：020101、020501、