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作成： 1997/11/10 斎藤 恭一
データ番号 ：010092
放射線グラフト重合法による疎水性クロマト用多孔性膜の作成と評価
目的 ：タンパク質の分離精製のための疎水性相互作用に基づく膜吸着材の開発
放射線の種別 ：電子
放射線源 ：電子加速器
線量（率） ：200kGy
利用施設名 ：日本原子力研究所高崎研究所2号加速器
照射条件 ：窒素中、室温
応用分野 ：タンパク質の分離精製、クロマトグラフィー
概要 ：
ポリエチレン製多孔性中空糸膜の孔表面にグラフトしたGMA(グリシジルメタクリレート)高分子鎖に疎水基としてフェニル基およびブチル基を導入した。0.5〜2.5mmol/gの密度で孔は埋まることはなく、基材の透過流束の80%であった。2M硫酸アンモニウム溶液を緩衝液としたウシ血清アルブミン溶液を透過させ高速吸着が可能であることを示した。また、フェニル基導入時のフェノール水溶液との反応では、グラフト高分子鎖の膨潤と収縮を制御することによってフェニル基の導入部位を均一あるいは上部に集中して付与できることを示した。
詳細説明 ：
疎水クロマト(疎水性相互作用クロマトグラフィー)は、イオン交換クロマトおよびアフィニティクロマトとならんで、タンパク質の分離精製に多用されている技術である。適度な疎水性表面をもつ吸着材(通常は疎水性基をもつビーズ状ゲル)にタンパク質溶液を接触させると、タンパク質表面の疎水性の強いタンパク質ほど強く吸着されるのを利用してタンパク質を分離精製することができる。
吸着材の性能として重要な評価基準は、吸着容量と溶出率の2点である。吸着容量を高めるためには吸着材表面の疎水性が強いほうが好ましく、その一方で溶出率を高めるためには疎水性が弱いほうが好ましい。したがって、材料表面の親水性／疎水性のバランスが重要である。市販の疎水クロマトゲルでは、親水性のアガロースゲルに適度の疎水性基(フェニル基やブチル基など)を導入することでこのバランスをとっている。この研究では、GMA膜に固定したポリ(GMA)グラフト鎖へのフェニル基導入位置を制御することで、孔表面の親水性／疎水性のバランスをとることを提案する。現在、多用されているビーズ状ゲルよりも、ここで提案する多孔性膜を用いた方が高速度でタンパク質の吸着分離を行うことができるので、有利である。
多孔性膜の孔表面へのフェニル基および水酸基の導入経路を図1に示す。
図1 Schematic diagram of procedure used to append phenyl and hydroxyl groups to polyethylene porous membrane.（原論文1より引用。 Reproduced from J. Chromatogr. A, 718, 27-34 (1995), Fig.1(p.28), N. Kubota, M. Kounosu, K. Saito, K. Sugita, K. Watanabe and T. Sugo, Preparation of a hydrophobic porous membrane containing phenyl groups and its protein adsorption performances;Copyright(1995), with permission from Elsevier Science.）
基材として、外径1.22mm、内径0.68mm、孔径0.2μm、および空孔率67%のポリエチレン製中空糸状多孔性膜を用いた。まず、基材膜に電子線を照射してラジカルを発生させた後、エポキシ基を有するビニルモノマー(グリシジルメタクリレート、GMA)を反応させ、基材膜の孔表面に、膜の1.5倍重量のポリ(GMA)グラフト鎖を固定した(以後、得られた膜をGMA膜と呼ぶ)。つぎに、GMA膜を1Mフェノール水溶液に浸漬し、ポリ(GMA)グラフト鎖のエポキシ基にフェニル基を導入した。さらに、0.5M硫酸に浸漬することによって、残存エポキシ基をジオール化した(以後、得られた膜をPh-diol膜と呼ぶ)。この一連の反応により、ポリ(GMA)グラフト鎖のエポキシ基は、フェニル基またはジオール基のどちらかに転化する。したがって、フェニル基の導入位置を制御できれば、自動的に、ジオール基の導入位置も制御できることになる。なお、フェニル基の導入量(ここでは、エポキシ基からフェニル基へのモル転化率として表す)を、フェニル基導入反応でのフェノール水溶液のpHおよび反応時間によって制御することができた。
ウシ血清アルブミン(BSA)をモデルタンパク質に用い、Ph-diol膜のタンパク質吸着容量および溶出率を測定した。膜に、(1) 2M硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)を含む0.2 mg/mLのBSA緩衝溶液(吸着操作)、(2) 2M (NH4)2SO4を含む緩衝液(洗浄操作)、および (3) (NH4)2SO4を含まない緩衝液(溶出操作)を順次全ろ過法にて透過させ、透過液中のBSA濃度を測定することによりBSAの吸着および溶出曲線を得た(図2)。
図2 Breakthrough and elution curves of BSA of the Ph(37)-diol-C fiber.（原論文1より引用。 Reproduced from J. Chromatogr. A, 718, 27-34 (1995), Fig.7(p.32), with permission from Elsevier Science.）
ここで緩衝液には、リン酸緩衝液(0.07M、pH 7.4 )を用いた。
フェニル基導入時のフェノール水溶液のpHは異なるが、フェニル基導入量が同一であるPh-diol膜の溶出率を図3に示す。
図3 Elution percentage of BSA of the Ph fiber as a function of pH of the phenol aqueous solution used for introduction of the phenyl group.（原論文2より引用。 Reproduced from Reactive & Functional Polymers, 29, 115-122 (1996), Fig.10(p.121), N. Kubota, M. Kounosu, K. Saito, K. Sugita, K. Watanabe and T. Sugo, Control of phenyl-group site introduced on the graft chain for hydrophobic interaction chromatography; Copyright(1996), with permission from Elsevier Science.）
高pHフェノール水溶液中で作成したPh-diol膜の溶出率が低いのは、グラフト鎖の上端付近のフェニル基密度が高いためにBSAとの疎水性相互作用が強く働き、溶出されにくくなったためと考えられる。したがって、疎水クロマト吸着材として用いるには、ポリ(GMA)グラフト鎖へのフェニル基導入を低pHフェノール水溶液で行ない、フェニル基がグラフト鎖全体に均一に導入されるよう制御することが望ましい。
コメント ：
多孔性膜を利用する膜クロマトグラフィーはタンパク質の高速分離精製法として有望である。現行のビーズクロマトグラフィーに対抗するためには、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティという3つのモードの膜が必要であった。この研究によって3つのモードに対応する多孔性中空糸膜が揃ったことになり、これからの利用が期待される。また、グラフト高分子鎖の長さ方向に官能基の密度分布を与える一つの工夫を示した点に価値がある。
原論文１ Data source 1：
Preparation of a hydrophobic porous membrane containing phenyl groups and its protein adsorption performances
N. Kubota, M. Kounosu, K. Saito, K. Sugita, K. Watanabe and T. Sugo
Chiba University and Japan Atomic Energy Research Institute
J. Chromatogr. A, 718, 27-34 (1995).
原論文２ Data source 2：
Control of phenyl-group site introduced on the graft chain for hydrophobic interaction chromatography
N. Kubota, M. Kounosu, K. Saito, K. Sugita, K. Watanabe and T. Sugo
Chiba University and Japan Atomic Energy Research Institute
Reactive & Functional Polymers, 29, 115-122 (1996)
原論文３ Data source 3：
Protein adsorption and elution performances of porous hollow-fiber membranes containing various hydrophobic ligands.
N. Kubota, M. Kounosu, K. Saito, K. Sugita, K. Watanabe and T. Sugo
Chiba University and Japan Atomic Energy Research Institute
Biotechnol. Prog., 13, 89-95(1997)
キーワード：疎水性相互作用、フェニル基、放射線グラフト重合、多孔性膜、中空糸、タンパク質、吸着、クロマトグラフィー
hydrophobic interaction, phenyl group, radiation-induced graft polymerization, porous membrane, hollow fiber, protein, adsorption, chromatography
分類コード：010201, 010203
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