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作成： 1996/12/25 斎藤　恭一

データ番号　　　：010039
アニオン交換膜を使ったタンパク質の高速吸着回収
目的　　　　　　：タンパク質を高速で回収できるアニオン交換多孔性膜材料の開発
放射線の種別　　：電子
放射線源　　　　：電子加速器
線量（率）　　　：200kGy
利用施設名　　　：日本原子力研究所高崎研究所
照射条件　　　　：窒素中、室温
応用分野　　　　：医薬品の精製、食品製造
概要　　　　　　：
　多孔性膜(市販のポリエチレン製精密濾過膜)の孔表面に、アニオン交換基としてジエチルアミノ基をもつグラフト高分子鎖を固定した。この膜にタンパク質溶液を透過させると、タンパク質が流れに乗ってアニオン交換基の近傍まで輸送されるので、拡散移動抵抗を無視できる高速の吸着回収を実現できた。グラフト高分子鎖中でのアニオン交換基の密度を高くすると、高分子鎖が相互反発によって立ち上がり、そこへタンパク質が積層され吸着する。アルブミンの場合、単層吸着量の約10倍の吸着容量を得た。
詳細説明　　　　：
　
　多孔性膜の膜厚方向にアニオン交換基をもつグラフト高分子鎖を均一に配置し、そこへタンパク質溶液を透過させ、膜へタンパク質を高速で、高容量で吸着回収する仕組みをつくりあげた(図1)。


図1　Processing of proteins using the porous and tentacle ion-exchange membrane.（原論文1より引用。　Reproduced from J. Chromatogr. A, Vol. 689, 211-218(1995), Fig.1(p.212), Tsuneda, S., Saito, K., Furusaki, S., Sugo, T., High-throughput processing of proteins using a porous and tentacle anion-exchange membrane; Copyright(1995), with permission from Elsevier Science.）

また、タンパク質の吸着と溶出を繰り返して行えることも実証した。

1.アニオン交換多孔性膜の作成
　精密濾過膜として市販されている多孔性中空糸膜(内径2mm、外径3mm、平均孔径0.34μmm、空孔率71%)に電子線を照射したのち、エポキシ基を有するビニルモノマー(glycidyl methacrylate, GMA)のメタノール溶液に浸してグラフト重合反応を行った。グラフト率を200%に設定した。その後、ジエチルアミンにGMAグラフト膜を浸してエポキシ基の一部をアニオン交換基であるジエチルアミノ(DEA)基へ変換した。残りのエポキシ基はエタノールアミンとの反応により、ヒドロキシアミノエチル(EA)基へ変換した。ジエチルアミンとの反応時間を変えることによってDEA基の密度を0〜2.9mol/kgの範囲で変化させた。
　　
2.アニオン交換多孔性膜の物性
　放射線グラフト重合およびその後の化学反応で得られたDEA基とEA基とをもつ多孔性中空糸膜の物性をまとめる。まず、元の膜に比べて膜体積は3.2倍に膨潤した。このため、膜の孔構造を走査電子顕微鏡(SEM)で観察すると、元の孔構造を維持していた。この膨潤はタンパク質溶液を透過させるのに都合がよい。つぎに、膜に塩素イオンを吸着させたのち、X線マイクロアナライザーを使って塩素の膜厚方向の分布を調べた。膜厚方向に均一であったことから、DEA基が中空糸膜の内面から外面まで均一に導入されていることが確認された。さらに、窒素吸着法により比表面積は5m2/gと測定された。比表面積はタンパク質の単層吸着量を算出するときに必要になる。
　　
3.アニオン交換多孔性膜を用いるタンパク質の吸着回収
(1)高速回収の実証：
　長さ8cmのアニオン交換多孔性中空糸膜(DEA-EA膜)にウシ血清アルブミン(BSA、分子量67,000、pI=4.7)を0.02M Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)に溶かした液(5mg/mL)を、流量20〜100mL/hで中空糸膜の内面から外面へ透過させた。このとき、液の膜内滞留時間は165〜33秒にあたる。膜外面からの流出液中のBSA濃度を流出液量の関数として測定した(破過曲線の測定)。その結果、流量に依存せず、破過曲線は重なった。これは,滞留時間が短くても長くても、透過液量が同一であれば、同一のBSA吸着量が得られることを示している。多孔性膜の孔表面から伸びたグラフト高分子鎖中のDEA基の近傍までBSAが透過流に乗って輸送されるので、拡散移動抵抗が無視できる理想的な吸着回収が行われた。
　
(2)高容量回収の実証：
　DEA基の密度を変化させた膜を使って、破過曲線を測定し、膜のBSA吸着容量を算出した。DEA基密度が高くなるにつれ、BSA吸着容量が増加した(図2)。


図2　BSA binding capacity as a function of a DEA group density.（原論文1より引用。　Reproduced from J. Chromatogr. A, Vol. 689, 211-218(1995), Fig.5(p.216), with permission from Elsevier Science.）

　DEA 基密度が2.9mol/kgのとき、最大で490g/kgとなった。これは、DEA基密度が増すとグラフト高分子鎖間の静電的反発によって高分子鎖が孔表面から孔内部方向へ立ち上がるので、それによって生じた空間にタンパク質が3次元的に積層して吸着したからである。これをtentacle吸着あるいは多層吸着と呼ぶ。実用的に好都合な現象である。膜の吸着容量を他の吸着材と比較して表1に示す。

表1　Summary of properties and protein adsorption performance of tentacle-type ion exchangers.（原論文1より引用。　Reproduced from J. Chromatogr. A, Vol. 689, 211-218(1995), Tab.1(p.216), with permission from Elsevier Science.）

  
    

      Support material 　
      Grafting 

      method 		
      Monomera 
      Protein 
      Monolayer

      adsorption

      (g/kg)b		
      Binding

      capacity

      (g/kg)		
    

    

      Type
      Shape 
      Structure
    

    

      PE

      

      

      

      

      PE 

      

      

      Fg 

      

      

      

      Si 		
      Hollow

      fibre 

      

      

      

      Hollow 

      fibre 

      

      Bead

      

      

      

      Bead		
       Porous 



      

      

      Porous 


      

      Non- 

      porous 


      

      Porous		
      Radiation 

      


      

      

      Radiation 


      

      Chemical 

      

      

      

      Chemical 		
      GMA-DEA 

      

      

      

      

      GMA-SS 


      

      DEAEAAm 

      AAc 

      AMPS 


      TMAEAAm 		
      Lacto- 

      globulin

      BSA 

      BGG 

      

      Lysozyme 


      

      BSA 

      Haemoglobin 

      Lysozyme 

      

      BSA 		
      15

      

      45

      93

      

      18

      

      

      

      

      

      


      		
      266

      

      49-490

      387

      

      40-200

      

      

      70-140g/l

      70-140g/l

      70-140g/l

      

      50		
    

  



PE = Polyethylene
Fg = Fractogelc
Si = Silica
a DEAEAAm = Diethylaminoethylacrylamide; AAc= acrylic acid; AMPS = 2-acry
lamide-2-methylpropanesulfonic acid; TMAEAAm = tyimethylaminoethylacrylami
de; GMA = glycidyl methacrylate; SS = sodium sulfide; DEA = diethylamine.
b Theoretical binding capacity for protein adsorbed as a monolayer with an 
end-on orientation on the ion exchanger.
c Copolymer of oligoethylene glycol,glycidyl methacrylate and pentaerythrol
dimethacrylate.
(3)繰り返し使用：
　BSAを吸着させた多孔性中空糸膜に、0.5MNaClを透過させて、BSAを溶出させた.溶出率は100%であった。その後、緩衝液を透過させたのち、再びタンパク質溶液を透過させるという操作を5回繰り返しても、吸着量に変化はなかった。これは、グラフト高分子鎖中で、DEA基に親水性基であるEA基が隣接していて、タンパク質の非選択的(不可逆)吸着を防いでいるためである。
コメント　　　　：
　高速、高容量、および繰り返し使用というタンパク質吸着回収材料に要求される3つの基準を満たす新しい材料が開発されている。放射線グラフト重合法の利点の一つである、任意の形状(ここでは多孔性中空糸膜)へ適用できることを生かして、市販されている精密濾過膜を基材として利用している点が特徴である。タンパク質の吸着回収には、多糖類アガロースをベースにした機能性ゲルビーズが利用されてきた。このビーズ充填カラムの性能を超えていることを示さない限り、この材料の実用化は進まない。今後、研究の進展が期待される。
原論文１ Data source 1：
High-throughput processing of proteins using a porous and tentacle anion-exchange membrane
Tsuneda, S., Saito, K., Furusaki, S., Sugo, T.*
Department of Chemical Engineering, University of Tokyo, Hongo, Tokyo 113, Japan,
*Takasaki Radiation Chemistry Research Establishment, Japan Atomic Energy Research Institute, Takasaki, Gunma 370-12, Japan
J. Chromatogr. A, Vol. 689, 211-218(1995)
参考資料１ Reference 1：
Tsuneda, S., Shinano, H., Saito, K., Furusaki, S., Sugo, T.
Biotechnol. Prog., Vol. 10, 76-81(1994)
キーワード：多孔性膜、テンタクル結合、多層結合、アニオン交換、タンパク質、高速回収
porous membrane, tentacle binding, multilayer binding, anion exchange, protein, high-rate collection
分類コード：010201, 010203

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