作成： 2000/03/10 谷田貝 文夫
データ番号 ：150017
がん抑制遺伝子に変異が起きると放射線による突然変異の誘発頻度は高くなる
目的 ：癌抑制遺伝子機能の「重イオン放射線による突然変異誘発」に及ぼす影響
研究実施機関名 ：理化学研究所 細胞生理学研究室／ラジオアイソトープ技術室
応用分野 ：放射線生物学、分子遺伝学
概要 ：
放射線の人体への遺伝的影響はわれわれの子孫にまでも及ぶ可能性がある。そこで、ヒト培養細胞のHPRT突然変異を指標として遺伝的影響を調べた。放射線からの防御に深く関与する「がん抑制遺伝子p53」に特定の変異が入ると、重イオン放射線の特定エネルギー領域でHPRT変異誘発頻度が高くなった。変異パターンには大きな影響はないようだが、質的影響については、標的遺伝子を変えたり別の解析手法を用いて、再検討する必要がある。
詳細説明 ：
1.研究の経緯
DNA 塩基配列レベルでの異常、すなわち突然変異を放射線リスク評価の有効な指標としていく為に、その遺伝子異常検出法とDNA塩基配列決定法を一体化し、効率的突然変異検出システムの確立を行なってきた。そこでは、ヒト培養細胞を利用して放射線照射によってHPRT遺伝子座に生じた突然変異の解析を試み、放射線の種類およびそのエネルギーの違いまでも反映する解析手法の構築を目指してきた。これらの目標下で得られた結果についてはすでに昨年度に報告した。ここでは、ヒト細胞で放射線からの防御で最も重要と考えられている「癌抑制遺伝子p53」に変異が入った場合、すなわち、変異p53遺伝子の放射線誘発変異に及ぼす影響について検討した結果を紹介する。
2.研究の成果
ヒトリンパ芽球様細胞TK6と由来は同じでもがん抑制遺伝子p53のDNA結合領域のコドン237に変異をもつWI-L2-NS細胞を用いて、変異p53遺伝子の重イオン放射線変異誘発に及ぼす影響についての検討を行った。X線照射したときにみられる、WI-L2-NS細胞がTK6細胞に比べて放射線抵抗性を示す現象は、炭素イオン(22 keV/mm)、ネオンイオン(67 keV/mm)でも再現することができた(図1)。
図1 各種重イオンビーム照射条件下でのWI-L2-NS細胞とTK6細胞の放射線感受性の比較
ただし、この現象は図1の照射条件A、すなわち、理研リングサイクロトロンで加速できる最大エネルギービームのときにみられ、放射線の相対的生物効果(RBE)のピークを示すLET領域(図1の条件B)やさらに高いLETのビームの止まり際領域(図1の条件 C)ではみられなかった(図省略)。鉄イオン照射は加速器の性能上、これよりも高いエネルギーのビームで照射できないので、また、浮遊状態での照射なので照射容器の厚みがあるために、その照射条件はAとBの中間型(A/B)にしかできない。結果は予測どおり、わずかに放射線感受性に差がみられるが、統計的に有為な差とはいえない。この感受性の差がみられる重イオン照射条件 (AまたはA/B)で独立に発生したHPRT変異クローンを収集して、その突然変異の質的な(変異スペクトル上の)相違を調べることにした(表1)。
表1 HPRT突然変異の誘発率(独立な変異クローン収集時)
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Heavy-ion TK6 WI-L2-NS
(LET;KeV/μm) ---------------------------------- -----------------------------------
Dose(Gy) SF MF(×10-6) Dose(Gy) SF MF(×10-6)
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C(22) 2 0.058±0.016 7.2±2.7 2.4 0.067±0.013 9.9±1.4
Ne(67) 1 0.056±0.007 12±3 1.2 0.18±0.03 37±10
Fe(1000) 2 0.25±0.007 13±11 2.4 0.27±0.01 20±6
Unirradiated 0 1.0 2.6±0.6 0 1.0 4±0.05
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この変異クローンを集めた条件でのHPRT変異誘発率(表1)から、X線照射の場合と同様にWI-L2-NS細胞がTK6細胞に比べて高頻度に変異を誘発する傾向がみられた(厳密な比較はできない)。この重イオン照射実験とほぼ同一の条件下で癌抑制遺伝子p53蛋白の誘導をウエスタンブロット法で調べたところ、X線照射の場合と同様に、照射後2時間経過したところでは一過的なp53蛋白の誘導は正常TK6細胞のみで観察され、変異をもつWI-L2-NS細胞では構成的に高レベルのp53蛋白発現がみられた(図省略)。p53遺伝子によって制御され、DNA修復への関与が示唆されているp21(Waf-1)遺伝子産物は、やはり予想どおり、p53蛋白が放射線照射により誘導されたときに発現されることが正常TK6細胞で確認された(図省略)。
図2 誘発されたHPRT突然変異の変異型による分類
ここで誘発されたHPRT変異クローンについて多重PCR法で解析し、変異のパターン別に分類してその相対的分布を検討した結果を図2にヒストグラフとしてまとめた。変異をもつWI-L2-NS細胞の方が正常TK6細胞よりもいくらか点突然変異を多く誘発する傾向がみられたが、増幅可能領域のパターンに顕著な差がないこと(図省略)などから、多重PCR法レベルでの検出では変異p53遺伝子はHPRT突然変異誘発に質的に大きな影響は与えていないものと推察される。しかしながら、多重PCR法では同一のパターンを示す、2種細胞由来の変異クローンがクロモソームペインティング法で異なる型の染色体異常(転座)を示すという興味深い例も見つかった(図省略)。したがって、今後、染色体レベルでその異常を詳細に検討する必要がある。
コメント ：
突然変異の特異性を支配する因子として、放射線の種類やエネルギーだけでなく、変異および染色体異常の誘発に関与する遺伝子群を明確にし、放射線照射後の細胞内でのこれらの遺伝子の発現についても追跡する必要がある。ここで紹介した研究からも、「放射線リスク評価技術」を構築する際に上述の細胞内因子について考慮に入れる必要性を強く示唆することができる。
原論文１ Data source 1：
Influence of p53-gene function on the speificity in hprt mutations induced by heavy-ions.
Morimoto S., Gordon A.J.E. , Fukunishi N., Hanaoka F.,and Yatagai F.
The Institute of Physical and Chemical Research (RIKEN)
RIKEN Accelerator Progress Report, 32, 154 (1999).
原論文２ Data source 2：
Effect of mutant p53 on the deletion profile of hprt mutations induced by heavy-ion irradiation.1Division of Radioisotope Technology, 2Cellular Physiology Laboratory, and 3 Cyclotron Center, The Institute of Physical and Chemical Research, Saitama 351-0198, Japan; 4Division of Genetics and Mutagenesis, National Institute of Health Sciences, Tokyo 158-8501, JAPAN.
Morimoto S., Gordon A.J.E. , Fukunishi N., Honma, M., Sofuni, T., Hanaoka F.,and Yatagai F.
The Institute of Physical and Chemical Research (RIKEN), National Institute of Health Sciences
Mutagenesis, submitted (2000)
参考資料１ Reference 1：
Analysis of Mutations in the Human HPRT Gene Induced by Accelerated Heavy-Ion Irradiation
Kagawa Y., Yatagai F., Suzuki M., Kase Y., Kobayashi A., Hirano M., KatoT., Watanabe M., and Hanaoka F.
The Institute of Physical and Chemical Research (RIKEN), Toray Research Center Inc., National Institute of Radiological Sciences, Osaka University, and Nagasaki University
J. Radiat. Res., 36, 185-195 (1995).
参考資料２ Reference 2：
LET dependence of cell death and chromatin-break induction in normal human cells irradiated by neon-ion beams
Suzuki M., Kase Y., Kanai T., Yatagai F., and Watanabe M.
National Institute of Radiological Sciences, Nagasaki University, The Institute of Physical and Chemical Research (RIKEN)
Int. J. Radiat. Biol., 72, 497-503 (1997).
参考資料３ Reference 3：
Complex HPRT deletion events are recovered after exposure of human lymphoblastoid cells to high LET carbon- and neon-ion beams
Kagawa Y, Shimazu T, Gordon A.J.E. , Fukunishi N, Inabe N., Suzuki M, Hirano M, KatoT, Watanabe M, and Hanaoka F. and Yatagai F
The Institute of Physical and Chemical Research (RIKEN), National Institute of Radiological Sciences, Nagasaki University, Osaka University, and Toray Research Center Inc.
Mutagenesis, 14, 199-205 (1999).
キーワード：重イオン照射, 線エネルギー付与率、ヒト胎児初代培養細胞、ヒポキサンチンリボシル転移酵素変異、多重PCR、点突然変異、欠失型突然変異、がん抑制遺伝子、シグナル伝達、クロモソームペインティング法
Heavy-ion, Linear Energy Transfer(LET), human embryo cell, HPRT Mutation,Multiplex PCR, point mutation, deletion mutation, tumor suppressor gene, signal transducrion, Chromosome painting method
分類コード：150101, 150302