作成： 1998/11/10 祖父尼 俊雄
データ番号 ：150009
染色体ペインティング法による放射線誘発染色体異常の検出
目的 ：放射線誘発染色体異常の検出技術の改良とその応用
研究実施機関名 ：国立医薬品食品衛生研究所変異遺伝部
応用分野 ：細胞遺伝学、放射線生物学、放射線治療学
概要 ：
放射線誘発染色体異常を効率的に且つ高精度に検出するために、分子交雑蛍光法を利用した染色体ペインティング法の有用性を検討した。X線照射ヒト培養リンパ球では照射線量に依存して染色体異常が検出された。さらに、放射線治療がん患者における末梢リンパ球においても染色体異常が検出され、被曝線量の推定が可能であった。本法は、従来の方法よりも精度が高まる上に、観察時間も大きく短縮され、効率的であった。
詳細説明 ：
1.染色体ペインティング法
染色体ペインティング法は、蛍光色素を標識した特定染色体に特異的DNAプローブを用いて、その染色体のみを染め分ける方法である。染め分けられた染色体に構造的な変化、例えば他の染色体との相互転座が生じると、1つの染色部位が2つに分かれることにより、容易に且つ客観的に染色体異常を検出することができる。但し、染め分ける染色体は一部、つまりヒトの染色体では46本(22対とXY)のうち2〜6本(1〜3対)のみを通常染め分けるので、染め分けられない染色体間の異常は検出できないことになる。これについては、他の染色体においても各染色体の長さに比例して同様に異常が誘発されると仮定して、全ゲノムの異常頻度を推定する。そのため、得られた結果が従来の方法と少なくとも同等の検出力のあることを確認する必要がある。
2.In vitro X線照射した培養ヒトリンパ球における染色体異常の検出
健康人より採取した末梢血にX線を照射(線量率128 rad/min)し、PHA(phytohemagglutinin)存在下全血培養後染色体標本を作製した。蛍光色素Spectrum Orangeで標識した4番染色体特異的DNAプローブを用いて染色体ペインティングを行った。Counter stainingはDAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)で行い、蛍光顕微鏡下、U励起（青の蛍光色）でDAPIによる全染色体を、G励起（緑の蛍光色）でSpectrum Orangeによる4番染色体を観察した。その結果、転座、二動原体染色体、挿入、断片などの異常が識別でき、4番染色体に関与した異常をもつ細胞の出現頻度は線量に依存して上昇した。
図1 染色体ペインティング法と従来の分染法による染色体異常検出の比較。 左側：転座(translocation)、右側：二動原体染色体(dicentric chromosome)。 ○ ：G-分染法(Hansmann et al. 1983, 150 kV X-rays)、●：G-分染法(Bauchinger and Gotz, 1979, 220 kV X-rays)、□：Q-分染法(Casperson et al. 1972)、■：染色体ペインティング法(Nakano et al. 1992, 220 kV X-rays)、△：染色体ペインティング法(本研究、220 kV X-rays)（原論文1より引用）
また、Q-, G-分染法によるこれまでの報告と比較しても、同等あるいはそれ以上の検出感度を示した(図1)。この方法では、異常の解析に経験をあまり必要とせず、さほどよい分裂細胞を選択する必要がなく、短時間に多数の分裂中期像を観察できるという利点が確認された。
3.放射線治療がん患者の染色体異常モニタリング
染色体ペインティング法が実際にヒトにおける染色体異常のモニタリングにどれだけ有効であるかを実証するために、放射線治療を受けたがん患者の末梢リンパ球を用いて検討した。患者は原則として、術後放射線治療のみを受けた患者6名を対象としたが、そのうち1名(RD4627)は、手術ができないほどがんが進行していたため、放射線治療と化学療法を同時に行った。患者は1週間に4回、毎回2.25GyのX線治療を受けた。健康な非喫煙の女性と、過去16年にわたり1日20本の割合で喫煙の習慣のある男性を対照群とした。
表1 4番染色体特異的DNAプローブを用いた染色体ペインティング法で検出された放射線治療がん患者の末梢血リンパ球の染色体異常（原論文2より引用）
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Patient Total dose No. of No. of No. of aberrations a
cells aberrant ------------------------------
(Gy) scored cells (%) t dic ins fb r complex
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Control 1 - 768 1( 0.13) 1 0 0 0 0 0
Control 2 - 918 1( 0.11) 1 0 0 0 0 0
RD 4598 40.5 1018 51( 5.01) 19 20 2 8 1 3
RD 4603 70.08 1128 35( 3.10) 20 7 0 7 0 1
RD 4608 49.5 1017 16( 1.57) 6 5 0 4 0 1
RD 4609 40.5 951 36( 3.79) 26 8 0 7 0 0
RD 4618 40.5 976 102(10.45) 71 25 2 20 0 1
RD 4627 51.75 969 139(14.34) 81 38 7 31 3 16
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a t:translocation, dic:dicentric, ins:insertion, f:fragment, r:ring chromosome
b Fragments associated with dicentrics and rings were excluded.
その結果、対照群の2名ではそれぞれ1個の転座が観察され、染色体異常をもつ細胞の出現頻度は0.13%と0.11%で、喫煙者と非喫煙者で差異は見られなかった。一方、がん患者では1.57%から14.34%の異常細胞の出現が認められ、対照群の10倍から100倍もの高い頻度であった(表1)。
表2 放射線治療患者にみられたゲノム当たりの転座出現頻度より推定した生物学的線量（原論文2より引用）
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Total dose Exposure Total No. No. of Estimated Equivalent
Patient Diagnosis (Gy) period of t per genomic frec. biological
(days) fraction cell of t per cell dose (Gy)a
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RD 4598 Stomach 40.5 32 18 0.0187 0.155 0.79
cancer
RD 4603 Prostate 70.08 57 30 0.0177 0.147 0.76
cancer
RD 4608 Hepato-cellular 49.5 39 22 0.00590 0.0490 0.29
carcinoma
RD 4609 Lung 40.5 32 18 0.0273 0.227 1.07
cancer
RD 4618 Lung 40.5 29 18 0.0727 0.604 2.17
cancer
RD 4627 Lung 51.75 38 23 0.0836 0.694 2.39
cancer
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a On the basis of the estimated genomic frequencies of translocations, the equivalent
biological dose for each patient was extrapolated from the relationship of the
translocation fequency to the X-ray dose in the in vitro experiment.
上述のin vitro X線照射実験で得られた転座の線量曲線と、がん患者で観察された転座の出現頻度を基に、患者それぞれについて「生物学的線量推定」を試みた(表2)。その結果、治療に用いた総線量と生物学的推定線量との間に相関は得られなかった。例えば、同じ40.5GyのX線を受けた2名の患者(RD4609, RD4618)は同じ年齢で、照射部位も同じ胸部であるが、推定線量に約2倍の違いがみられた。後者は末期患者で、術後の転移を防ぐために広範囲に、特にリンパ節に照射を受けているので、これが両者の違いに関連している可能性がある。
また、70.08Gyという高線量のX線照射を受けた患者(RD4603)の染色体異常頻度は40.5Gyを受けた患者(RD4609)と同程度であった。前者が前立腺がんで後者が肺がんであることから、前者の照射範囲が後者よりかなり狭いことが異常頻度の低いことと関連している可能性がある。最も異常頻度が高かったのは化学療法を併用していた患者(RD4627)で、抗がん剤の多くは染色体異常を誘発することが知られていることから、恐らく化学療法による影響が含まれているものと考えられる。以上のように種々の要因を加味して考えると、得られた生物学的推定線量は患者に生物学的に影響をもたらすであろう線量と考えることができる。患者に与える影響を最小限にしつつ、がん転移の防止に有効となる放射線治療を考える上では、このような指標は重要な情報となるものと考えられる。
コメント ：
分子交雑蛍光法を利用した染色体ペインティング法においては、多様なDNAプローブが開発され、その手法も多様化している。各染色体における遺伝子の増幅、欠失を検出するCGH(Comparative Genomic Hybridization)法も広く利用されている。また、ヒトの全染色体を染め分けることも可能になり、分子交雑蛍光法の利用が広範囲になってきている。
原論文１ Data source 1：
Chromosome painting analysis of X-ray-induced aberrations in human lymphocytes in vitro
Matsuoka, A., Tucker, J. D., Hayashi, M., Yamazaki, N. and Sofuni, T.
National Institute of Health Sciences, Japan, and Lawrence Livermore National laboratory, U.S.A.
Mutagenesis, 9, 151-155, 1994
原論文２ Data source 2：
Chromosomal aberrations detected by chromosome painting in lymphocytes from cancer patients given high doses of therapeutic X-rays
Matsuoka, A., Yamada, K., Hayashi, M. and Sofuni, T.
National Institute of Health Sciences, and Research Institute, International Medical Center of Japan, Tokyo.
J. Radiat. Res., 37, 257-265, 1996.
原論文３ Data source 3：
放射線誘発染色体異常および突然変異の解析の高精度化：染色体ペインティング法と遺伝子導入系の利用
祖父尼 俊雄
国立医薬品食品衛生研究所(前国立衛生試験所)
原子力工業、42(7), 9-13, 1996.
キーワード：染色体異常、染色体ペインティング、分子交雑蛍光法、生物学的線量推定
chromosome aberration、chromosome painting、fluorescence in situ hybridization (FISH)、biological dosimetry
分類コード：150101, 150102, 150203